A másodlagos kezelés eltávolítja az oldható szerves anyagokat, a tápanyagokat (például a nitrogént és a foszfort) és a legtöbb olyan szilárd anyagot is, amelyet az elsődleges kezelés során nem sikerült. Itt általában olyan biológiai folyamatokat használnak, amelyek során a mikrobák metabolizmus útján lebontják a növekedésükhöz és szaporodásukhoz szükséges szerves összetevőket és tápanyagokat. A másodlagos kezelés során a két leggyakoribb biológiai folyamat a kötődéses növekedési és a szuszpendált növekedési rendszer. A szuszpendált növekedés elősegíti a szennyvízben és a visszaforgatott aktivált iszapban már megtalálható önálló mikroorganizmusok pelyhekbe tömörülését. Ezek a pelyhek különböző aerob, anoxikus és anaerob környezetek segítségével képesek eltávolítani a szennyeződéseket. A szennyeződések eltávolítása után következik a másodlagos tisztítási folyamat, amelynek során a pelyheket gravitáció segítségével kiszűrik a vízből. A másodlagos tisztítóegység alján visszamaradó iszapot ekkor visszaküldik (aktiváltiszap-visszatérítés), így az az elsődleges kifolyással együtt kiadja a kevert folyadékot. A folyamat során visszamaradó iszapot (eleveniszapot) eltávolítják, hogy ideális környezetet teremtsenek a mikroorganizmusok számára. A kötődéses növekedési rendszerek úgy működnek, hogy a mikroorganizmusok egy hordozóra kötődve biofilmet hoznak létre. A leülepedett szennyvizet összekeverik a biofilm-bevonatú hordozóval vagy rálocsolják arra, ahol aztán a mikroorganizmusok eltávolítják a szennyeződéseket. A szuszpendált növekedéshez hasonlóan a biofilm részei és a szuszpendált pelyhek szétválasztás céljából a másodlagos tisztítóegységbe kerülnek. Itt aztán az iszapot újra felhasználják, a szennyvizet és a tisztított vizet pedig továbbküldik a folyamat következő szakaszába.
A biológiai kezelés megfelelő működéséhez kiegyensúlyozott tápanyagtartalomra (a szén, a nitrogén és a foszfor megfelelő arányára, vagyis C:N:P arányra), valamint nyomelemekre, például vasra, rézre, cinkre, nikkelre, magnéziumra, káliumra, kénre és más, a szennyvízben jellemzően előforduló anyagokra van szükség. Az általánosan elfogadott C:N:P arány 100:5:1, bár egyes létesítmények ettől eltérő aránnyal is kiváló eredményeket érnek el, míg más helyeken poliszacharidos iszapképződés következik be, vagy elszaporodnak a fonalas baktériumok, és lerakódnak a másodlagos tisztítóegységben.
A másodlagos kezelést többféle biológiai folyamattal is el lehet végezni, ideértve a levegőztetőmedencék áramlásszabályozását, a kevert levegőtartályokat, a szekvenciális kötegreaktorokat, az oxidációs csatornákat, a csepegtetőszűrők használatát, a biológiaágyas reaktorok mozgatását, az integrált, kötött filmes aktivált iszap használatát stb.
A biológiai tápanyag-eltávolítás (BNR) megváltoztatja a mikroorganizmusok környezetét, hogy el lehessen távolítani a vízből a nitrogént és a foszfort. A BNR-folyamat anaerob (oxigén- és nitrátmentes), anoxikus (oxigénmentes, nitráttal) és aerob (oxigénnel) lépcsőkből áll, amelyek során a víz több kamrán folyik át, és különböző biológiai funkciókat végez el.
Vegykezelési folyamatokat is lehet használni, ilyen például a foszfor vegyi eltávolítása. A levegőztetőmedencékben és a tisztítóegységekben vegyi anyagok hozzáadásával flokkuláció útján is eltávolítható a foszfor: a nem oldódó összetevők megkötik a foszfort, majd leülepszenek, így iszap formájában eltávolíthatók.